FUT8 细胞系逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验步骤

  FUT8 细胞系逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验步骤​:
  一、总RNA的提取
  1、获得高纯度、高质量的总RNA;
  2、可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR 和阵列分析所需。
  二、cDNA第一链的合成
  目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
  1. 在0.5 ml微量离心管中,加入总RNA 1-5 μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo(dT)12-18 1 μl,轻轻混匀、离心;
  2.70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min;
  3. 取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA 2 μl;上游引物(10 pM) 2 μl;下游引物(10 pM) 2 μl;dNTP(2mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl) 1 μl。轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5 min;
  4.加入SuperscriptⅡ1 μl ,在42℃水浴中孵育50 min;
  5. 于70℃加热15 min以终止反应;
  6.将管插入冰中,加入RNase H 1 μl ,37℃孵育20 min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。
  三、PCR
  1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA 2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;
  2.加入适量的ddH2O,使总体积达50 μl。轻轻混匀,离心;
  3.设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照;
  4.电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;
  5.密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。
  注意事项:
  1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;
  2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;
  3.内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;
  4. PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定;
  5. 防止DNA的污染: 采用DNA酶处理RNA; 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。

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